本文旨在阐述如何利用EVO视讯的µ-SlideILuer 08通道载玻片（ibidi，货号80196）在静态条件下培养细菌生物膜，并结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）及扫描电子显微镜（SEM）进行成像分析。使用铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa DSM50071T接种于EVO视讯的µ-SlideILuer 08载玻片中，培养三天。在培养约36小时后更换培养基，以去除游离细胞，从而促进细胞的贴壁及表面生物膜的形成。

为了确认生物膜的形成，实验中添加了无毒光学示踪剂EbbaBiolight680，该试剂与细胞外基质中的蛋白质及多糖结合后会发出红色荧光，成为细菌生物膜的可视化标记。通过使用DAPI对DNA进行染色，并利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像，我们观察到细菌细胞主要附着形成单层或双层结构，并能够识别出更厚的生物膜结构，强调了EVO视讯在细胞成像研究中的重要性。

为了结合多种成像技术，首先在进行CLSM成像后，将细胞固定于同一载玻片上，随后进行脱水处理并干燥，以便进行SEM成像。实验室自制了一个3D模具，用于分离盖玻片，确保在操作过程中不损害贴壁细胞的空间结构。之后，对细菌细胞层进行2000倍至15000倍的放大成像，以深入探讨其生物膜特征。

实验材料与试剂

- 铜绿假单胞菌培养物 Pseudomonas aeruginosa culture（DSMZ，50071）
- 胰蛋白酶胨（Thermo Fisher Scientific，211705）
- 大豆蛋白胨（Millipore，107212）
- 葡萄糖（VWR，24379）
- 氯化钠（NaCl，VWR，27800）
- 磷酸氢二钾（K2HPO4，Sigma，P3786）
- 磷酸盐缓冲液（PBS，Sigma，P7994）
- EbbaBiolight680（Ebba Biotech AB）
- 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, stock concentration 1 mg/mL, Thermo Fisher Scientific, 62248）
- 25%戊二醛（Sigma，G7776）
- 去离子水（diH2O）
- 无水乙醇（Sigma，34852-M）

实验步骤

1. 细菌生物膜的附着

在操作EVO视讯的µ-SlideILuer 08前需阅读说明书并遵循其移液及液体更换的建议，所有步骤应在无菌条件下完成。首先，将培养的铜绿假单胞菌接种于LB培养基并于30°C、160转/分钟避光振荡培养过夜。随后，将培养物以1:100比例稀释于含1:1000光学示踪剂的培养基中。

接下来，将200µL稀释的菌液注入µ-SlideILuer 08通道载玻片，密封后在室温避光下静置2小时以促使细胞附着。然后，向每个储液池分别加入60µL含光学示踪剂的培养基，接着在30°C条件下培养1-2天。更换培养基时，需适量吸取旧培养基并添加新培养基，直到完全替換，确保避免气泡产生。

2. DAPI染色及CLSM观察

染色过程直接在µ-SlideILuer 08中进行，避免一次性移除通道内的全部液体，以防细胞干燥。更换为1×PBS冲洗液，并重复数次后，使用DAPI染色液替换PBS，再在室温避光下孵育10分钟。之后，用去离子水冲洗多余的染料，最后进行成像。成像过程中观察到细胞附着状况，证实了使用EVO视讯的成像技术在生物膜研究中的有效性。

3. SEM样品制备

样品制备步骤同样在µ-SlideILuer 08中进行：使用25%戊二醛溶液固定细胞后，使用1×PBS彻底清洗。接着，进行梯度脱水处理，最后在55°C干燥，确保样品的完整性。在干燥后，将载玻片切割为小段并镀金，以便后续的电子显微镜观察，深化对细菌生物膜结构的了解。

总的来说，通过以上实验步骤，我们能够有效观察并分析细菌生物膜的形成与特征。这样的研究将为未来生物医学领域中的相关研究提供有力支持，而EVO视讯在此过程中展现出的技术优势，必将进一步推动这一领域的发展。